© Martin Wolsing
& WWaaWW 1999

Isolation

Ved gensplejsning ønsker man at overføre et gen fra en organisme til en anden organisme. For at kunne gøre det kræver det, at man har isoleret det gen man ønsker at overføre. Det kan gøres på flere forskellige måder.
En mulighed er at klippe hele donor-organismens genom i små stykker, overføre hver enkelt stykke DNA til en værtsorganisme og så håbe på at en af dem har fået hele det ønskede gen. Denne metode kaldes populært for shotgun-metoden fordi det svarer til at skyde i blinde. Det er mere eller mindre tilfældigt om en af værtsorganismerne får det ønskede gen, og hvis den gør er det ikke særligt "rent" - dvs. det indeholder en stor mængde DNA som ikke koder for det protein man ønsker.
Den anden mulighed er mere nøjagtig og ikke nær så arbejdskrævende. Normalt ved man hvilket protein det ønskede gen koder for, og når man kender proteinet kan man ved hjælp af en aminosyresekvensanalyse bestemme de første 15-20 aminosyrer. De kan så oversættes til en DNA-sekvens hvorefter man, på en maskine, producerer en kunstig DNA-streng med den sekvens man lige har fundet frem til - denne streng kaldes en DNA-probe. I denne proces skal man sørge for at DNA-proben er genkendelig, det gør man ved at mærke den med en radioktivt isotop. Se figur 2.1.

Figur 2.1 Fremstilling af radioaktivt mærket DNA-probe.		Figur 2.2 Fremstilling af cDNA Ved hjælp af forskellige enzymer fremstilles cDNA ud fra mRNA.

I donorcellen isolerer man nu alle de mRNA der produceres. Hvis det er i en eukaryot organisme, hvad det normalt er, er det meget nemt: Alle eukaryote mRNA har nemlig en lang hale af A'er efter sig. Til denne isolation bruges et rør fyldt med filtermateriale hvor der er bundet lange kæder af T'er fast. Derfor vil alt uden A-haler løbe lige igennem røret, mens mRNA med de lange A-haler bliver fastholdt. På den måde sorterer man alt det fra der ikke koder for protein.
Ved hjælp af enzymer er man nu i stand til at fremstille cDNA. Først laver et enzym en komplementær DNA-streng til mRNA, dernæst fjerner et andet enzym mRNA-strengen og til sidst dannes den komplementære DNA-streng af et tredie enzym. På denne måde får man en blanding af dobbelstrengede DNA stykker der præcis svarer til de forskellige mRNA stykker der var i cellen. I praksis vil der være omkring 1000 forskellige DNA-stykker, hvilket er langt mindre end ved shotgun-metoden. Se figur 2.2.

Da hver stykke DNA kun findes i en meget lille mængde sætter man en vektor på DNAet, normalt anvendes plasmider som vektorer. For senere hen at kunne selektere, anvendes plasmider med to resistensgener fx. penicillin og tetracyklin. Plasmidet åbnes med et restriktionsenzym midt i det ene resistensgen, det kunne være tetracyklin-resistensgenet, der nu er i to halvdele og derfor ikke fungerer. Derefter blandes plasmidet med DNA stykkerne og enzymet ligase, hvis funktion er at klistre løse DNA stumper sammen. En stor del af plasmiderne vil bare klistre sammen til en ring igen og derved få gendannet det ødelagte resistensgen, men nogle af dem vil danne ringe med cDNA stykkerne, og derfor ikke få gendannet resistensgenet.
Herefter blandes plasmiderne med en kultur af E. coli og nogle af bakterierne vil optage et plasmid som derved bliver formeret.

Figur 2.3 Indsætning af cDNA i plasmid.

Det er nu nødvendigt at selektere for de bakterier der har optaget et plasmid og vel og mærke et plasmid med et indsat stykke cDNA.
Ved at tilsætte penicillin til kulturen dræbes alle de bakterier der ikke har penicillin-resistens, dvs. alle dem der ikke har optaget et plasmid.
Herefter testes de enkelte kolonier for om de er tetracyklin-resistente. Hvis de er det, er tetracyklin-resistensgenet intakt, dvs. de ikke har optaget cDNA. Nu står vi altså tilbage med de kolonier der indeholder et plasmid med cDNA.
Fra hver koloni overføres nogle celler til noget specielt papir som binder DNA. Bakterierne ødelægges og vaskes bort, hvorefter de to DNA-strenge tvinges fra hinanden. Nu tilsættes den radioaktive probe fra tidligere. Den vil selvfølgelig kun binde til den DNA-sekvens den passer til. Nu ved man altså hvilke kolonier der har optaget den rette DNA sekvens og dermed det rette gen.
Sekvensen klippes nu ud af plasmidet med det samme restriktionsenzym man brugte til at starte med. Resultat: Man har nu fået isoleret den DNA-sekvens, dvs. det gen, der koder for det protein man ønskede.